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Western Blotting 操纵步调
一、Western Blotting 实行步调概述

1、 构造取材:构造块称重

2、 应用液氮、研钵破碎摧毁构造块

3、 到场RIPA缓冲液(每克构造3ml RIPA),PMSF(每克构造30μl,10 mg/ml PMSF),

应用Polytron进一步匀浆(15,000转/分*1分钟)保持4℃

4、 到场PMSF(每克构造30μl,10 mg/ml PMSF),冰上孵育30分钟

5、 移入离心管4℃,约20,000g(约15,000转)15分钟

6、 上清液为细胞裂解液可分装-20℃生存

7、 停止Bradford比色法测定蛋白质浓度

8、 与雷同质量的细胞裂解液(体积*蛋白质浓度),并加等体积的2×电泳加样缓冲液

9、 滚水浴中3分钟

10、上样

11、电泳(稀释胶20mA,星散胶35mA)

12、电转膜仪转膜(100mA 40分钟)

13、膜用丽春红染色,胶用考马斯明蓝染色

14、Westernblot 试剂盒显色

15、剖析对照纪录

二、Western Blotting 详细实行步调

Western,也称Western blot、Western blotting、Western 印迹,是用抗体检测卵白的主要要领之一。

Western能够参考以下步调停止操纵:

1、收集卵白样品(Protein sample preparation)

能够运用恰当的裂解液裂解揭壁细胞、悬浮细胞或构造样品。关于某些特定的亚细胞组份卵白,比方细胞核卵白、细胞浆卵白、线粒体卵白等,能够参考相干文献提取这些亚细胞组份卵白,也能够运用试剂盒停止抽提。

收集垮台黑样品后,为确保每一个卵白样品的上样量同等,需求测定每一个卵白样品的卵白浓度。凭据所运用的裂解液的差别,需求接纳恰当的卵白浓度测定要领。由于差别的卵白浓度测定要领关于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差异很大。若是运用北京博奥森生物技术公司消费的WIP细胞裂解液,能够运用BCA卵白浓度测定试剂盒。

2、电泳(Electrophoresis)

(1)、SDS-PAGE凝胶配制

SDS-PAGE凝胶能够参考一些文献资料停止配制,也能够运用博奥森消费的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。该试剂盒供应了除火和配胶用具中的一切试剂和配制种种浓度SDS-PAGE的配方。

(2)、样品处置惩罚

正在收集的卵白样品中到场适当稀释的SDS-PAGE卵白上样缓冲液。比方2X或5X的SDS-PAGE卵白上样缓冲液。运用5X的SDS-PAGE卵白上样缓冲液能够减小上样体积,正在雷同体积的上样孔内可以上样更多的卵白样品。5X的SDS-PAGE卵白上样缓冲液能够参考相干文献资料配制,也能够运用博奥森消费的SDS-PAGE卵白上样缓冲液(5X) 。100℃或滚水浴加热3-5分钟,以充裕变性卵白。

(3)、上样取电泳

冷却到室温后,把卵白样品曲接上样到SDS-PAGE胶加样孔内便可。为了便于视察电泳结果和转膜结果,和判定卵白分子量巨细,最好运用预染蛋白质分子量尺度。

电泳时一般推荐正在上层胶时运用低电压恒压电泳,而正在溴酚蓝进入基层胶时运用下电压恒压电泳。关于Bio-Rad的尺度电泳装配或相似电泳装配,低电压能够设置正在80-100V,下电压能够设置正在120V阁下。SDS-PAGE能够接纳一般的电泳仪便能够知足要求。为了电泳轻易起见,也能够接纳全部SDS-PAGE过程恒压的体式格局,一般把电压设置正在100V,然后设定准时工夫为90-120分钟。设置准时能够制止常常发作的电泳过甚。

一般电泳时溴酚蓝抵达胶的底端处四周便可住手电泳,大概能够凭据预染蛋白质分子量尺度的电泳状况,估计目标卵白曾经被恰当星散后便可住手电泳。

3、转膜(Transfer)

我们推荐正在Western实行中选用PVDF膜。硝酸纤维素膜(NC膜)或PVDF膜(二氟化树脂膜膜孔径:0.45um)也能够运用,但硝酸纤维素膜对照脆,正在操作过程中特别是用镊子夹与等历程中轻易裂开。膜的运用请参考生产商的推荐运用步调。

一般若是运用Bio-Rad的尺度湿式转膜装配,能够设定转膜电压120V,转膜工夫为30-60分钟。详细的转膜工夫要凭据目标卵白的巨细而定,目标卵白的分子量越大,需求的转膜工夫越少,目标卵白的分子量越小,需求的转膜工夫越短。

正在转膜历程中,特别是下电流快速转膜时,一般会有异常严峻的发烧征象,最好把转膜槽安排正在冰浴中停止转膜。转膜的结果能够观察所运用的预染蛋白质分子量尺度,一般分子量最大的1-2条带较易悉数转到膜上。转膜的结果也能够用丽春红染色液对膜停止染色,以视察现实的转膜结果。也能够用考马斯明蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶停止染色,以视察卵白的残留状况。

4、关闭(Blocking)

转膜终了后,立刻把卵白膜安排到预先预备好的Western洗涤液中,漂洗1-2分钟,以洗去膜上的转膜液。从转膜终了后所有的步调,一定要注重膜的保湿,制止膜的枯燥,不然极易发生较下的配景。

用微型台式真空泵吸尽洗涤液,到场Western关闭液,正在摇床上迟缓动摇,室温关闭60分钟。关于一些配景较下的抗体,能够正在4℃ 关闭留宿。

5、一抗孵育(Primary antibody incubation)

参考一抗的说明书,根据恰当比例用Western一抗稀释液稀释一抗。

用微型台式真空泵吸尽关闭液,立刻到场稀释好的一抗,室温或4℃正在侧摆摇床上迟缓动摇孵育一小时。若是一抗孵育一小时结果欠安,能够正在4℃迟缓动摇孵育留宿。收受接管一抗。到场Western洗涤液,正在侧摆摇床上迟缓动摇洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后,再加入洗涤液,洗涤5-10分钟。共洗涤3次。若是效果配景较下能够恰当延伸洗涤工夫并增添洗涤次数。

6、二抗孵育(Secondary antibody inucubation)

参考二抗的说明书,根据恰当比例用Western二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)符号的二抗。

用微型台式真空泵吸尽洗涤液,立刻到场稀释好的二抗,室温或4℃正在侧摆摇床上迟缓动摇孵育一小时。收受接管二抗,到场Western洗涤液,正在侧摆摇床上迟缓动摇洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后,再加入洗涤液,洗涤5-10分钟。共洗涤3次。若是效果配景较下能够恰当延伸洗涤工夫并增添洗涤次数。

7、卵白检测(Detection of proteins)

参考相干说明书,运用BeyoECL, Western 荧光检测试剂等ECL类试剂去检测卵白。

洗片时能够运用X光片主动洗片机。若是没有主动洗片机,能够用显影定影试剂盒自行配制显影液和定影液停止手工洗片。

8、膜的反复应用(Membrane recovery)

若是卵白样品异常珍贵,能够运用Western一抗二抗去除液处置惩罚卵白膜,以反复应用卵白膜。

三、实行注意事项

1、 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上;

a. 转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜,将硝酸纤维素膜铺正在凝胶上,用5ml移液管正在凝胶上往返转动去除所有的气泡

b. 正在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸(预先用转移缓冲液浸湿),将凝胶夹正在中央,连结潮湿和没有气泡

c. 将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸根据厂家发起要领放入电泳装配中,凝胶面向阴极

d. 将上述装配放入缓冲液槽中,并灌谦转移缓冲液以吞没凝胶

e. 根据厂家所示接通电源最先电泳转移

f. 转移完毕后,掏出薄膜和凝胶,弃去凝胶

2、 将薄膜漂正在氨基乌中快速染色,直至分子量尺度展现时掏出,纪录下尺度位置;

3、 用100ml水洗涤纤维素膜,需要时可用脱色缓冲液;

4、 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时;

5、 室温下,用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜

6、 用封口机将薄膜封入塑料袋中,尽量不留空气;

7、 袋的一角剪一缓冲液的小口,用透析袋夹紧;

8、 混淆:NGS(100微升),印迹缓冲液中的抗体(2.5-5毫升),加正在装薄膜的袋中,于室温下动摇2小时(或4℃留宿);

9、 用总体积300ml PBS-Tween缓冲液,分4次正在一浅盘中洗涤薄膜,每次75ml;

10、将衔接生物素的羊抗兔IgG(40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升 NGS)加正在袋内,于室温下动摇1小时;

11、按步调9洗涤;

12、到场抗生素卵白-HRP(40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升 NGS),于室温下动摇;

13、Western Blot中转移正在膜上的卵白处于变性状况,空间结构改动,因而那些辨认空间表位的抗体不克不及用于Western Blot检测。这种情况能够将表达目标卵白的细胞或细胞裂解液中的一切卵白先生物素化,再用酶符号亲和素停止Western Blot。实行中取胶和膜需带手套。

四、关于内参抗体

推荐产物:本公司自立研发的β-Actin肌动蛋白(抗体),产品编号:bs-0061R

本公司的内参抗体bs-0061R具有以下特性上风:

1、经亲和层析纯化的稀释液(或冻干粉),该抗体质量凌驾外洋任何公司的同种产物;

2、用于Western Blotting为异常清楚的一条带稀释比达1:400;

3、用于免疫组化表达位置正确,特异性强、效价高;

4、分子量:42Kda,凭据需求可供应种种差别的包装;

5、IgG含量为100μg/0.2ml 500ug/1ml;

6、价钱仅为0.1ml/480.00元人民币;

7、只需4℃生存运输,有效期:-20℃液体长达两年(冻干粉状况长达5年以上);

8、产物用度低 ,机能稳固、质量牢靠、易于生存;

9、该抗体实用普遍,可用于人、羊、狗、猪、牛、兔、鸡和大、小鼠等植物种属卵白检测;

尽人皆知,要用Western Blot对照差别条件下大概差别构造中,目标卵白表达量的相对若干,前提条件是等量的卵白上样,才有对照的根蒂根基。特别是正在表达量不高时,上样量的差异便很可能影响效果的剖析。以是需求内参做对照。

内参即是内部参照(Internal Control),关于哺乳动物细胞表达来讲一样平常是指由管家基因编码表达的卵白(Housekeeping Proteins),它们正在各组织和细胞中的表达相对恒定,正在检测卵白的表达程度转变经常用它去做参照物。正在Western Blotting 实行中,除需求停止卵白抽提、卵白定量、等量卵白上样电泳、转膜、靶卵白抗体孵育、显色等步调之外,借需求停止内参的检测,以校订蛋白质定量、上样历程中存在的实行偏差,以包管实行效果的准确性。

在国外宣布的文章中,Western Blotting 实行效果须停止内参校订已成为一种老例。然则,海内仍有很多科研人员正在Western Blotting实行中疏忽了内参的运用,将卵白浓度测定作为范例需互相对照的种种样品间上样量同等的独一要领。但是种种蛋白质浓度定量要领,皆存在局限性,不克不及完整正确确实定种种样品的正确卵白浓度。 蛋白质定量今后停止电泳时需求等量上样,此步调也存在操纵偏差。正在Western blotting实行时运用内参,便可轻便天对定量和上样步调发生的偏差停止校订。另外运用内参能够作为空缺对比,检测卵白转膜状况是不是完整、全部Western Blot显色大概发光系统是不是一般。

实行效果剖析实在很简朴:若是样品卵白量有限,只够停止一次电泳转膜实行时,离别检测样品的内参量和目标卵白量。将百般品目的卵白量离别除以其内参含量,获得的数值即为内参校订后的百般品中目标卵白相对含量,再用此数值停止样品间的对照和剖析,获得目标卵白含量正在差别样品间的现实转变效果。若是样品量充裕,能够先检测内参,观察样品间内参显色条带是不是同等,凭据差别巨细调解百般品的上样量从新停止Western Blotting实行,至内参量同等为止;若内参同等,便可停止差别样品间目标卵白表达转变剖析。如许固然贫苦一点,然则能够包管效果更有说服力,更可托。究竟结果我们的实行是一种松散的事情。

五、实行中泛起的题目及处置惩罚设施

1、为何带泛起拖尾征象?

缘由:重要是样品融解结果欠安或星散胶浓度过大引发的;

处置惩罚设施:加样前离心,挑选恰当的样品缓冲液,加适当样品促溶剂;电泳缓冲液工夫过长,从新配制;低落凝胶浓度。

2、为何带泛起纹理征象?

缘由:重要是样品不溶性颗粒引发的;

处置惩罚设施:加样前离心,加适当样品促溶剂。

3、为何电泳的条带很粗?

缘由:电泳中条带很粗是常见的事,重要是已稀释好的缘由;

处置惩罚设施:恰当增添稀释胶的长度,包管稀释胶贮液的pH准确(6.7),恰当低落电压。

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