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免疫荧光Immunofluorescence


    免疫荧光染色手艺是将荧光素作为抗体符号物停止免疫组织化学染色,带有荧光素的抗体孵育后能够间接运用荧光显微镜观察。该手艺的主要特点是:特异性强、敏感性下、速度快;瑕玷是因为荧光素有肯定的淬灭周期,玻片没法临时生存,需求正在染色完毕后尽快停止镜下观察剖析。
免疫荧光染色分为间接法和直接法。间接法是荧光素间接符号正在一抗上,孵育后间接观察,快速高效,借能够取多个符号抗体一同做多重荧光染色。直接法是荧光素符号正在二抗上,比拟间接法染色配景更清洁,用度破费也少。

    免疫荧光染色取免疫组化前期处置惩罚雷同,由于内源性过氧化物酶对免疫荧光实行出有影响,同时双氧水反而会滋扰到荧光素发光,以是那步操纵正在免疫荧光中不需要做。
常用的荧光显微镜一样平常有三个通路,引发波长为350nm、488nm、555nm四周,离别对应的荧光发射光色彩为蓝光、绿光、红光。
350nm常用荧光素:DAPI(复染用),Alexa Fluor 350
488nm常用荧光素:FITC,Alexa Fluor 488
555nm常用荧光素:PE、Cy3、Rhodamine B、Alexa Fluor555
另有其他常见荧光素
594nm常用荧光素:Texas Red、Alexa Fluor594
647nm常用荧光素:Cy5、APC、Alexa Fluor647

    免疫荧光两重染色荧光单染或多重染色是指将带有差别荧光素符号的抗体孵育正在同一张切片上,镜下视察时将差别的色彩组合在一起,将差别的抗原表达状况一同显现出来,如许剖析多个抗原的关联性更客观、更间接。
荧光双染也有间接法和直接法。间接法是运用带有差别荧光素符号的两个抗体同时孵育后观察;直接法需求用到两个差别种属泉源的一抗(比方一个鼠源抗体,一个兔源抗体),前面要挑选取一抗相对应的二抗同时需求带有差别的荧光素符号(比方FITC符号山羊抗小鼠和Cy3符号山羊抗兔),直接法需求同时统筹一抗和二抗的种属干系,制止泛起互相的交织回响反映。


北京博奥森生物白腊切片的免疫荧光单染(直接法)
1.白腊切片一般脱蜡至水,PBS洗5分钟,2次
2.抗原修复,0.01M枸橼酸修复液,滚水浴热修复15分钟
3.一般山羊血清关闭20分钟,37℃
4.一抗孵育,4℃留宿。
5.PBS洗5分钟,3次
6.荧光符号二抗孵育,37℃,90分钟
7.PBS洗5分钟,3次
8.DAPI复染,PBS洗5分钟,3次
9.防淬灭荧光启片剂启片
10.镜检

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