客服热线:400-901-9800          客服QQ:4009019800          手艺答疑     技术支持     质量反应     联络我们
葡京热
首页 > 技术支持 > 注释


免疫组化Immunohistochemistry

一、概述
1、界说
用符号的特异性抗体对构造切片或细胞标本中某些化学成分的散布和含量停止构造和细胞原位定性、定位或定量研讨,这类手艺称为免疫组织化学(immunohistochemistry)手艺或免疫细胞化学(immunocytochemistry)手艺。
2、道理
凭据抗原抗体反应和化学显色道理,构造切片或细胞标本中的抗原先和一抗联合,再利用一抗取符号生物素、荧光素等的二抗停止回响反映,前者再用符号辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AKP)等的抗生物素(如链霉亲和素等)联合,最初经由过程呈色回响反映或荧光去显现细胞或构造中化学成分,正在光学显微镜或荧光显微镜下可清楚瞥见细胞内发作的抗原抗体回响反映产品,从而可以或许正在细胞爬片或构造切片上原位肯定某些化学成分的散布和含量。
3、分类
1)按符号物资的品种,如荧光染料、放射性同位素、酶(重要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)、铁蛋白、胶体金等,可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。
2)按染色步调可分为间接法(又称一步法)和直接法(二步、三步或多步法)。取间接法相比,直接法的灵敏度进步了很多。

3)按联合体式格局可分为抗原-抗体联合,如过氧化物酶-抗过氧化物酶(PAP)法;亲和衔接,如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)法、链霉菌抗生物素卵白-过氧化物酶贯穿连接(SP)法等,个中SP法是对照常用的要领;聚合物链接,如即用型二步法,此要领特别适合于内源性生物素含量下的构造抗原检测。
4、实行所用标本
实行所用重要为构造标本和细胞标本两大类,前者包孕白腊切片(病理切片和构造芯片)和冰冻切片,后者包孕构造印片、细胞爬片和细胞涂片。个中白腊切片是建造构造标本最常用、最根基的要领,关于构造形状生存好,且能做一连切片,有利于种种染色对比视察;借能临时存档,供回忆性研讨;白腊切片建造历程对构造内抗原袒露有肯定的影响,但可停止抗原修复,是免疫组化中首选的构造标本制作方法。
5、实行所用抗体
免疫组化实行中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。单克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆排泄的抗体,运用细胞融合杂交瘤手艺免疫植物制备。多克隆抗体是将纯化后的抗原间接免疫植物后,从植物血中所得到的免疫血清,是多个B淋巴细胞克隆所发生的抗体混合物。

二、免疫染色
上面以白腊切片的免疫组化为例演示具体操纵流程(SP法):
1.60℃烤片2小时
2.脱蜡。二甲苯脱蜡15分钟,三次
3.水化。顺次经由无水乙醇、95%、90%、80%、70%,各5分钟,蒸馏水(或自来水)5分钟
4.PBS(洗液C-0079)洗5分钟,三次
5.抗原修复。枸橼酸缓冲液(修复液,C-0070)(约92-95℃)煮沸(滚水浴)修复15分钟,天然凉至室温。PBS洗5分钟,三次
6.3%双氧水(包罗正在SP-0023中)消化内源性的过氧化物酶,20分钟,PBS洗5分钟,三次
7.一般山羊血清(包罗正在SP-0023中)关闭,37℃20分钟
8.一抗孵育,4℃留宿. (抗体稀释液C-0007)
9.PBS洗5分钟,三次
10.二抗孵育,37℃20分钟(二抗为生物素符号的羊抗兔IgG,包罗正在SP-0023中),PBS洗5分钟,三次
11.三抗孵育,37℃20分钟(三抗为辣根酶符号的链霉亲和素,包罗正在SP-0023中),PBS洗5分钟,三次
12.DAB(显色剂C-0010)显色,镜下视察效果,合时停止
13.苏木素(C-0021)复染5分钟,自来水冲刷少焉,1%的盐酸酒精(75%)溶液(此试剂没法贩卖,请自行设置,配制比例为:100ml 75%酒精+1ml浓盐酸)分化30秒,自来水冲刷5分钟蓝化
14.脱水。顺次经由70%、80%、90%、95%、无水乙醇,各5分钟,二甲苯15分钟,三次
15.启片,中性树胶(C-0073)启片

三、有关免疫组化实行的主要题目
(一)构造质料处置惩罚
1.取材要与新颖构造,巨细适宜,用生理盐水洗净
2.流动流动就是把病理标本构造浸泡正在流动液中(常用的有4%多聚甲醛),使构造或细胞内蛋白质凝结、沉淀或变性成为不溶性物资,并连结细胞原有的形状构造
3.洗涤流动后一定要把渗出到构造内里的流动液洗去,以利于停止脱水,若构造中留有较多的流动液,则将影响脱水剂,以至可正在构造中发作沉淀而影响后续染色及视察,关于陈腐性标本或流动工夫过长的标本,更应注重流水冲刷。
4.脱水脱水必需完全,若脱水不尽,则切片后构造取氛围打仗即枯燥膨胀,蜡块切面泛起凸起征象,虽可委曲切片,但染色结果差,染色时也轻易脱落
5.通明乙醇等脱水剂不克不及消融白腊,以是浸蜡之前需求一个既能取乙醇混淆又能消融白腊的媒剂,以便使白腊浸入到构造中去,当构造中悉数被通明剂占偶然,光芒能够透过,构造可显现差别水平的通明状况,此征象称为通明。若是构造不克不及通明,注解脱水已尽必需从新返工,不然影响到浸蜡的停止,但返工时每每结果欠好
6.浸蜡浸蜡工夫凭据构造的范例可恰当调解,一样平常原则较小构造脱水工夫和浸蜡工夫较短;骨、肌肉等坚固构造脱水和浸蜡工夫不宜过长;脂肪构造、松散结缔组织脱水和浸蜡工夫需增添
7.包埋包埋时应注重构造的包埋偏向,不然将影响构造切片的形状。包埋用的白腊要和浸蜡用的白腊熔点同等,包埋用的白腊温度要稍高于浸蜡的温度。包埋好后可置于冷水中使白腊敏捷冷凝。包埋好的白腊块应呈匀称的半透明状,如泛起红色污浊则个中存在白腊的结晶,这类蜡块不克不及切除薄的切片。能够是构造脱水不充分,构造内或白腊中混有通明剂,或包埋时行动太缓或白腊凝固太缓而至,以是冷却时水温不克不及过高,不然便不宜敏捷凝固
8.切片能够将建造好的蜡块置于高温情况预冷,切出的切片连续性较好,有利于展片,一样平常切片厚度4-6um
(二)抗原修复
构造正在建造历程中,因为流动液的感化关闭了抗原,又因为热的感化以致局部抗原的肽链发作扭曲,以致正在免疫组化的染色历程中不克不及将其显现出来,为了处理上述的题目,应用化学试剂和热的感化将这些抗原从新袒露出来或批改过来的历程称为抗原修复。
北京博奥森常用的抗原修复液有:0.01M枸橼酸(pH6.0)、0.05M EDTA(pH8.0)、0.01M TBS(pH7.4)、胃蛋白酶、胰蛋白酶
北京博奥森常用的抗原修复要领:
要领1:滚水浴修复,将盛有修复液和玻片的烧杯置于滚水浴情况,连结内部沸腾状况15min,天然冷却至室温。
要领2:微波修复,将盛有修复液和玻片的烧杯置于微波炉中,下水5min,停火3min,中水5min,天然冷却至室温。
要领3:高压修复,修复液到场高压锅加热至沸腾,放入玻片,启盖加压连续加热至喷气时最先计时修复2min,天然冷却至室温。
要领4:运用胃蛋白酶修复,将胃蛋白酶修复液到场到组织上,37℃,消化30min

抗原修复,必需注重以下题目:
1、修复液的挑选。
0.01M枸橼酸(pH6.0):运用最多的抗原修复液,适用于大多数的抗原,用该液修复后的抗原表达加强,抗原的定性和定位很幻想,效果不错;
0.05M EDTA(pH8.0):运用较多的抗原修复液,修复才能较强,关于生存工夫较少的切片或目标卵白表达较强的构造有很好的修复结果,需求掌握好修复工夫,不然轻易泛起较重的配景;
0.01M TBS(pH7.4):中性修复液,适用于大多数抗原,关于审定位卵白有较好的修复结果;
胃蛋白酶:运用较多的抗原修复液,适用于大多数的抗原,运用温度37℃,关于轻易脱片的切片有很好的珍爱感化。
胰蛋白酶:运用较多的抗原修复液,适用于大多数的抗原
2.抗原热修复时应挑选最好温度。
据实验以为温度正在92℃-98℃是适宜的,特别正在95℃为最好,那是由于:(1)这类温度已达沸腾,切片不容易离开载玻片;(2)可以或许解离和损坏取卵白交联的甲醛醛键等,处置惩罚时能够随便挑选和肯定抗原修复的感化工夫。若是挑选高压修复,由于温度较下,工夫不宜过长
3.抗原修复时有效温度所需持续时间凭据各单位的装备前提和运用的仪器差别,抗原修复时正在有用的温度范围内所连续的工夫也不一样。
4.抗原修复液必需遵照天然降温规律,不然结果欠好或达不到抗原修复的目标。
5.只管运用充足的抗原修复液,防备切片干枯。
6.切片必需附揭牢靠,不然发作失落片。

(三)适宜的抗体稀释度
抗体的浓度是免疫染色的要害,若是抗体浓度过高,抗体份子过多于抗原决意簇,可致使抗体联合削减,发生阴性效果。此阴性效果并不一定是短少抗原,而是因为抗体过量,这类征象类似于凝集反应中的前带效应(prozone effect)。因而,必需运用一系列稀释做“棋盘式效价滴定”,检测抗体的适宜稀释度,以获得最大强度的特异性染色和最弱的配景染色。抗体稀释度应凭据:1.抗体效价高,溶液中特异性抗体浓度越下,事情稀释度越高;2.一样平常讲,运用的抗体稀释度越大,温育工夫越少;3.关于抗体取非特同性卵白的联合,只要下稀释度时才气防备其非特同性配景染色;4.稀释用缓冲液的品种,标本的流动和处置惩罚历程等也可影响稀释度,以是适宜的稀释度应根据具体情况测定。抗体的稀释重要是指第一抗体,由于第一抗体中特异性抗体适宜的浓度是要害,运用下稀释度第一抗体仅下亲和力的特异性染色回响反映,削减或消弭个中交织抗体回响反映。
(四)血清关闭,削减非特同性联合
构造中非抗原抗体回响反映泛起的阳性染色称为非特同性配景染色,最常见的缘由是卵白吸附于下电荷的胶原和结缔组织身分上。最有用要领是正在用第一抗体前加取制备第二抗体雷同植物的非免疫血清(1:5-1:20),关闭组织上带电荷基团而撤除取一抗非特同性联合。需要时到场2%-5%牛血清白蛋白,可进一步削减非特同性染色,感化工夫为10-20min。免疫荧光染色时,可用0.01%伊文蓝(PBS溶液)稀释荧光抗体,对消弭配景的非特同性荧光染色有很好的结果。洗涤用的缓冲液中到场0.85%-1%NaCl成为下盐溶液,充裕洗涤切片,能有用的削减非特同性联合而削减配景染色。

(五)设置对比
其目标在于证实和一定阳性效果的特异性,扫除非特同性疑问。重要是针对第一抗体对比,常用的对比要领包孕:1. 阳性对比;2. 阴性对比;3. 阻断实行; 4.替换对比;5. 空缺对比;6. 本身对比;7. 吸取实行.
1. 阳性对比用已知抗原阳性的切片尴尬刁难照取待检标本同时停止免疫组织化学染色,对比切片应呈阳性效果,成为阳性对比。证实全过程均相符要求,特别当待检标本显现阴性效果时,阳性对比尤其主要。
2.阴性对比用确证不露已知抗原的标本尴尬刁难照,应呈阴性效果,成为阴性对比,是阴性对比的一种。实在空缺、替换、吸取和抑止皆属于阴性对比。当待检标本呈阳性效果时,阴性对比便越发主要,用以扫除假阳性。
(五)显色视察
免疫酶染色应注重掌握:
1. 呈色质浓度和反应时间。增添成色量的量和(或)增添底物反应时间,可增加回响反映产品强度;着色太深可削减反应时间。
2. 过氧化物酶显色时,H2O2浓度较上将使显色回响反映过快而至配景加深;过量H2O2能够抑止酶的活性。
(六)免疫组化效果的判定
对免疫组化效果的判定应持科学的稳重立场,要正确判定阳性和阴性,扫除假阳性和假阴性效果,必需严厉对比实行,对新发现的阳性效果,除有对比实行效果以外,应停止屡次反复实行,可用几种要领停止考证。必需学会判定特异性染色和非特同性染色,对初学者更为重要,不然会得出不科学的结论。特异性染色和非特同性染色的判别点重要在于特异性回响反映产品常散布于特定的部位。如胞浆内,也有散布正在细胞核和细胞外面的,即具有结构性。特异性染色显示为正在统一切片上显现差别水平的阳性染色效果。非特同性染色显示为无一定的散布规律,常呈某一部位成片的匀称着色,细胞和四周的结缔组织均无区分的着色,或结缔组织显现很强的染色。非特同性染色常泛起正在枯燥切片的边沿,有刀痕大概折叠的部位。正在过大的构造块,中央流动不良也会致使非特同性染色。偶然可见非特同性染色和特异性染色同时存在,因为过强的非特同性染色配景不只影响对特异性染色效果的视察和纪录,并且使人对其特异性效果发生疑心。
免疫组化的呈色深浅可反应抗原存在的数目,可作为定性、定位和定量的根据。
1.阳性细胞染色散布有三品种型:细胞浆、细胞核、细胞膜外面。大部分抗原见于细胞浆,可见于全部胞浆或局部胞浆
2.阳性细胞散布可分为灶型和弥漫性
3.因为细胞内含抗原量差别,以是染色强度纷歧。若是细胞之间染色强度雷同,常提醒其回响反映为非特同性
4.阳性细胞染色定位于单个细胞,且取阴性细胞互相交杂散布;而非特同性染色常不限于单个细胞,而是累及一片细胞。
5.切片边沿、刀痕或褶皱地区,坏死或挤压的细胞区,胶原结缔组织等,常显示为雷同的阳性染色强度,不克不及用于判定阳性。
(七)染色失利的几种缘由
1.所染的悉数切片均为阴性效果,包孕阳性对比在内,悉数呈阴性回响反映,缘由能够是:(1)染色已按严厉操纵步调停止;(2)漏加一种抗体,或抗体生效;(3)缓冲液内含叠氮化钠,抑止了酶的活性;(4)底物中所加H2O2量少或生效;复染或脱水剂运用欠妥。
2.一切切片均呈弱阳性回响反映:(1)切片正在染色历程中抗体过浓,或枯燥了;(2)缓冲液配制中未加氯化钠或pH不正确,洗涤不完全;(3)运用已变色的呈色底物溶液,或呈色反应时间过长;(4)抗体温育的工夫过长;(5)H2O2浓度过高,呈色速度过快;(6)粘附剂太厚。
3.一切切片配景过深:(1)未用酶消化处置惩罚切片;(2)切片或涂片过薄;(3)漂洗不敷;(4)底物呈色回响反映过暂;(5)蛋白质关闭不敷或所用血清溶血;(6)运用齐血清抗体稀释不敷。
4.阳性对比染色优越,检测的阳性标本呈阴性回响反映,流动和处置惩罚欠妥是最常见的缘由。关于阳性效果的定量判定,通例要领是凭据呈色深浅和阳性细胞数目分类计数,以(-)、+、++、+++等分级和计数统计。

版权所有 2016-2020 www.bioss.com.cn 北京博奥森生物技术有限公司 京公网安备110107000727号
经由过程国际质量管理系统ISO9001:2008 GB/T19001-2008认证    编号:00115Q211807R1M/1100